第一代Sanger测序法，由Sanger等在1997年提出，基本原理是通过双氧核糖核苷酸进行延伸反应，生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，再通过凝胶电泳使它们分开，最后通过放射显影读出待测DNA上的核酸序列。

第二代（Next-generation sequencing，NGS）高通量测序法，引入可逆终止末端，并对其荧光标记，从而实现边合成边测序。优点是高通量，可定量，成本低廉，但是读长较短，一般不超过500bp。

第三代测序技术即单分子测序技术，包括单分子实时（Single Molecule Real-time，SMRT）测序技术和单分子纳米孔（Nanopore）测序技术，优点为超长读长且无需扩增。

虽然第三代测序已经商用了，但目前主流测序技术还是NGS，以下从其测序过程对其简单介绍。

一、文库构建

1、基因组文库构建

①　通过物理性（超声波法、喷雾法或水动力剪切等）机械打碎和酶消化切割等手段将提取到的基因组DNA随机打断。

②　打断的DNA片段末端可能带有5’—凸出和3’—凸出，且其末端不一定存在磷酸基团或者羟基基团。因此，需要使用Taq聚合酶补齐不平的末端，同时使用Klenow 酶在两个末端添加碱基A。此过程即为末端修复，修复后的即可链接测序接头。

③　测序接头是已知的用于测序识别的序列，包括有与固定在流动槽中寡核苷酸序列互补的序列（P5/P7）和簇生成引物序列（Read SP）以及标签序列（Index），添加完接头序列的DNA片段集合即为所建基因组文库。

④　建库过程中含有聚合酶、连接酶等以及其他各种杂质，需要对其进行磁珠纯化，纯化过程中同时进行片段选择。纯化后的片段两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序，所以还要进一步用与接头互补的引物来PCR扩增。扩增完，进一步磁珠纯化，洗去杂质。

2、转录组文库构建

转录组是指特定细胞或组织中全部转录产物，包括信使RNA（Messenger RNA,mRNA）、核糖体RNA（Ribosomal RNA,rRNA）、转运RNA（Transfer,tRNA）以及其他非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）。不同类型的RNA文库制备方法各不相同，主要过程有：

①　目标RNA富集，方法包括靶向捕获目标RNA和消除rRNA。前者通常使用Oligo-dT与Poly（A）杂交的特性设计探针，从而实现总RNA中捕获到聚腺苷酸化RNA；后者方法较多，包括有Ribo-Zero-seq法、RNA消化酶法以及根据rRNA特性来消除rRNA的方法等。

②　通过化学方法或者酶消化的方法打断富集到的RNA，或者将RNA反转录成cDNA，运用DNA片段化方法打断cDNA。

③　连接接头。cDNA测序接头连接方法与DNA建库方法一致；小RNA长度20—35nt且5’端有磷酸基团、3’端有羟基基团，因此不需要特殊修饰即可与接头连接。

NEBNext Ultra II ＲNA 试剂盒( New England Biolabs) 文库制备流程

二、成簇Cluster Generation

利用有单链引物的流动槽将DNA分子片段固定在流动槽上扩增，形成单克隆DNA簇。

①　文库片段（P5/P7）与芯片表面引物互补配对，被固定后进行DNA复制。复制完后解链，将文库片段洗去，留在流动槽表面的即为文库模板互补的DNA链。

②　留下的互补链与原先模板链连接的引物结合，形成单链桥，再在聚合酶的参与下生成互补链，最终形成双链桥。

③　双链桥再次变性后形成单链，形成的单链又分别与自己配对的引物结合，重复这个循环，形成散布在芯片上的DNA簇。

④　进一步再切断洗去反向链（与模板链一致），仅留下正向链，且封锁3’端防止重新形成单链桥。

成簇Cluster Generation

三、测序Sequencing

向已经处理过的流动槽中添加改造过的DNA聚合酶和带有荧光标记的可逆终止dNTP（3’-OH链接叠氮基团，在延伸时被阻止连接下一个dNTP），统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。由于测序仪每次测序时的通量比较大，所以每次测得的序列可能不止一个样本，为了做区分，在建文库时在接头序列加入不同Index（或Barcode）区分来源。

现在主流测序方法为双末端（Paired-end）测序，因为可以增长测序长度且方便分析结构变异。一般是洗掉前面复制好的合成片段，单链继续在流动槽表面形成“桥式连接”。NaOH使双链变性为单链，并洗去已经测序完成的P7上DNA，留下P5’链。加入簇生成引物Read2，从相反方向进行另一端序列读取。

四、测序数据

以上则为二代测序的整个过程，不同的平台会存在一些差异，但总体过程类似。测序完成后，基于文库构建时添加的Index分类来自不同样本的序列，这些序列再与参考基因组匹配后，得到完整序列。